IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) waa isku-darka substrate-ka β-galactosidase, kaas oo si aad ah loo kicin karo. Marka la isticmaalo IPTG, soo-saareyaashu waxay samayn karaan isku-dhafan oo leh borotiinka cadaadiska, si loo beddelo qaabka borotiinka cadaadiska, si aan loogu dari karin hidda-wadaha bartilmaameedka ah, hidda-wadaha bartilmaameedka ahna si hufan ayaa loo muujiyaa. Haddaba sidee loo go'aamin karaa isku-darka IPTG inta lagu jiro tijaabada? Ma ka weyn yahay kan ka wanaagsan?
Marka hore, aan fahamno mabda'a soo saarista IPTG: E. coli's lactose operon (walax) wuxuu ka kooban yahay saddex hiddo-side oo qaab-dhismeed ah, Z, Y, iyo A, kuwaas oo codeeya β-galactosidase, permease, iyo acetyltransferase, siday u kala horreeyaan. lacZ wuxuu hydrolyzes lactose u beddelaa gulukoos iyo galactose, ama allo-lactose; lacY wuxuu u oggolaanayaa lactose deegaanka inuu dhex maro xuubka unugyada oo uu galo unugga; lacA wuxuu kooxda acetyl ka wareejiyaa acetyl-CoA una beddelaa β-galactoside, taas oo ku lug leh ka saarista saameynta sunta ah. Intaa waxaa dheer, waxaa jira taxane hawlgal O ah, taxane bilow ah P iyo hiddo-side sharciyeysan I. Koodhka hiddo-side I waa borotiin cadaadis celiya oo ku xidhi kara booska O ee taxanaha hawlwadeenka, si operon (meta) loo cadaadiyo oo loo damiyo. Waxaa sidoo kale jira goob isku xiran oo loogu talagalay goobta isku xidhka borotiinka-CAP ee firfircoonida hidda-wadaha ee ka soo horjeeda taxanaha bilowga ah ee P. Taxanaha P, taxanaha O iyo goobta isku xidhka CAP waxay ka kooban yihiin gobolka sharciyeynta ee lac operon. Hidde-sidayaasha koodhaynta ee saddexda ensaym waxaa nidaamiya isla gobolka sharciyeynta si loo gaaro muujinta isku-dubaridka ah ee alaabada hidda-wadaha.
Marka lactose la waayo, lac operon (meta) waxay ku jirtaa xaalad cadaadis ah. Waqtigan xaadirka ah, lac repressor-ka oo lagu muujiyo taxanaha I ee hoos yimaada xakamaynta taxanaha promoter PI wuxuu ku xidhmaa taxanaha O, kaas oo ka hortagaya polymerase-ka RNA inuu ku xidhmo taxanaha P wuxuuna joojiyaa bilaabista qoraalka; marka lactose la joogo, lac operon (meta) ayaa la kicin karaa Nidaamkan operon (meta), soo-saaraha dhabta ah maaha lactose laftiisa. Lactose wuxuu galaa unugga waxaana kiciya β-galactosidase si loogu beddelo allolactose. Kan dambe, oo ah molecule soo-saare ah, wuxuu ku xidhmaa borotiinka soo-saare wuxuuna beddelaa qaab-dhismeedka borotiinka, taasoo horseedda kala-goynta borotiinka soo-saare ee taxanaha O iyo qoraalka. Isopropylthiogalactoside (IPTG) wuxuu leeyahay saameyn la mid ah allolactose. Waa soo-saare aad u awood badan, kaas oo aan lagu dheefshiidin bakteeriyada waana mid aad u deggan, sidaa darteed si weyn ayaa loogu isticmaalaa shaybaarrada.
Sidee loo go'aamiyaa heerka ugu wanaagsan ee IPTG? Tusaale ahaan u qaado E. coli.
Nooca E. coli BL21 ee hidde ahaan loo farsameeyay oo ka kooban pGEX-ka dib-u-habaynta wanaagsan (CGRP/msCT) ayaa lagu tallaalay dareere LB ah oo ka kooban 50μg·mL-1 Amp, waxaana lagu beeray habeenkii heerkul ah 37°C. Dhaqanka kor ku xusan waxaa lagu tallaalay 10 dhalo oo ah dareere cusub oo LB ah oo 50mL ah oo ka kooban 50μg·mL-1 Amp oo leh saamiga 1:100 ee dhaqanka fidinta, markii qiimaha OD600 uu ahaa 0.6~0.8, IPTG ayaa lagu daray fiirsashada ugu dambeysa. Waa 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1. Ka dib markii la kiciyo heerkul isku mid ah iyo waqti isku mid ah, 1 mL oo ah xalka bakteeriyada ayaa laga soo qaaday, unugyada bakteeriyadana waxaa lagu soo ururiyay centrifugation waxaana lagu sameeyay SDS-PAGE si loo falanqeeyo saameynta kala duwan ee fiirsashada IPTG ee muujinta borotiinka, ka dibna la doorto fiirsashada IPTG ee leh muujinta borotiinka ugu weyn.
Tijaabooyin ka dib, waxaa la ogaan doonaa in fiirsashada IPTG aysan ahayn mid aad u badan intii suurtogal ah. Tani waa sababta oo ah IPTG waxay leedahay sun gaar ah oo ku dhacda bakteeriyada. Ka gudubka fiirsashada ayaa sidoo kale dili doonta unugga; guud ahaanna, waxaan rajeyneynaa in borotiinka milma ee ku jira unugga uu ka sii wanaagsanaado, laakiin xaalado badan marka fiirsashada IPTG ay aad u sarreyso, xaddi badan oo ka mid noqoshada ayaa la samayn doonaa. Jirka, laakiin xaddiga borotiinka milma ayaa hoos u dhacay. Sidaa darteed, fiirsashada IPTG ee ugu habboon badanaa ma aha mid weyn oo ka sii fiican, laakiin fiirsashada oo hooseysa.
Ujeedada kicinta iyo beerista noocyada hidde-sidaha lagu sameeyay waa in la kordhiyo wax-soo-saarka borotiinka bartilmaameedka ah iyo in la yareeyo kharashyada. Muujinta hidda-wadaha bartilmaameedka ah ma aha oo kaliya saameynta ay leedahay nooca iyo muujinta plasmid-ka, laakiin sidoo kale xaaladaha kale ee dibadda, sida xoojinta kicinta, heerkulka kicinta iyo waqtiga kicinta. Sidaa darteed, guud ahaan, ka hor inta aan la muujin oo la nadiifin borotiin aan la garanayn, waxaa ugu wanaagsan in la barto waqtiga kicinta, heerkulka iyo xoojinta IPTG si loo doorto xaaladaha ku habboon loona helo natiijooyinka tijaabada ugu fiican.
Waqtiga boostada: Diseembar-31-2021